00:00 
Генная терапия обещает предотвратить и вылечить заболевания путем манипулирования экспрессией генов в клетках пациента. Однако, чтобы быть эффективным, новый ген должен проникнуть в ядро ??клетки. Неспособность последовательно и эффективно делать это препятствовала прогрессу в продвижении лечения.
Исследователи Калифорнийского университета в Сан-Диего во главе с лабораторией профессора кафедры биохимии и молекулярной биофизики Нила Девараджа представили новый метод, который значительно увеличивает эффективность доставки генов, одновременно сводя к минимуму вредные побочные эффекты для клетки. Их работа опубликована в Nature Communications.
Чтобы генная терапия была эффективной, введенный ген должен быть доставлен в клетки-мишени, в конечном итоге перемещаясь из цитоплазмы клетки в ядро. Хотя доставка генов в цитоплазму хорошо известна и стандартизирована, доставка генов из цитоплазмы в ядро ??может быть довольно сложной задачей.
Чтобы компенсировать низкую эффективность ядерной транслокации (по оценкам, около одного процента), потенциальная генная терапия может потребовать очень высоких доз ДНК, чтобы гарантировать, что адекватное количество достигнет ядра. Эти высокие дозы могут вызвать иммунные реакции и цитотоксичность.
Доставка ДНК в ядро ??может осуществляться с помощью сигналов ядерной локализации (NLS) — коротких пептидных последовательностей, которые действуют как молекулярные почтовые коды, помечая определенные белки для транспортировки в ядро. Присоединение ДНК к NLS позволяет ей добраться до ядра. Хотя этот метод находился в разработке в течение нескольких десятилетий, результаты до сих пор были непоследовательными и их трудно воспроизвести.
Эта методология столкнулась с рядом проблем, самая большая из которых заключалась в том, что до сих пор химия не была достаточно развита, чтобы позволить ученым действительно наблюдать и понимать, что происходит во время доставки ядра ДНК-NLS. Имеет ли значение длина NLS? Имеет ли значение пространство между NLS и ДНК? Используют ли исследователи неправильную последовательность NLS? Должны ли они присоединять к ДНК несколько NLS?
Нужно было найти способ проверки всех этих переменных, чтобы исследователи могли легко определить, какие перестановки дали наилучшие результаты. Это именно то, что создала лаборатория Девараджа, когда разработала химический рабочий процесс, который позволяет легко проверять конъюгаты ДНК-NLS, позволяя пользователям определять параметры конъюгаций.
При создании этого рабочего процесса мы смогли провести надежные скрининги, по сути определяя правила проектирования, которые позволяют прикрепить один из этих NLS-пептидов к кассете гена ДНК. Мы увидели более чем десятикратное увеличение доставки ядерной ДНК».
Зульфикар Мохамедшах, аспирант биохимии и первый автор статьи
Как это делается
Новый рабочий процесс был адаптирован на основе технологии ферментативного мечения ДНК, DNA-TAG, ранее разработанной в лаборатории Девараджа. В этой работе команда использовала бактериальный фермент TGT (тРНК-гуанин). трансгликозилаза) для модификации ДНК с помощью химической ручки, которая обеспечивает последующее легкое присоединение пептидов к ДНК, включая пептиды NLS.
Благодаря этому рабочему процессу лаборатория смогла модифицировать кассеты генов ДНК — мобильные фрагменты ДНК — с помощью пептидов NLS, а затем изменить параметры NLS: тип используемого NLS, пространство между NLS и ДНК и количество NLS, прикрепленных к ДНК. закодирован репортером eGFP, который флуоресцирует зеленым светом в клетках человека при доставке и экспрессии в ядро.
Таким образом, они смогли проверить различные перестановки конъюгатов ДНК-NLS, чтобы увидеть, какие комбинации наиболее эффективны при проникновении в ядро. Этот новый рабочий процесс скрининга позволяет исследователям точно определять и использовать конъюгаты ДНК-NLS с самой высокой доставкой в ядро.
"Мы смогли получить экспрессию из ДНК, нацеленной на ядро. больше, чем экспрессия немодифицированной ДНК в десятикратном объеме", - заявил Деварадж, один из соавторов статьи и заведующий кафедрой биохимии. "Это означает, что вы можете доставить в клетку меньше ДНК, одновременно увеличивая экспрессию, что должно смягчить проблемы цитотоксичности".
Конечная цель любой генной терапии — лечить больных пациентов, поэтому, чтобы проверить ее рабочий процесс, команда разработала генную кассету, кодирующую фактор IX, белок, дефицитный при болезни Кристмас, редкую Их результаты показали, что экспрессия фактора IX в 10 раз выше, чем в контрольной группе, что подчеркивает потенциал конъюгатов ДНК-NLS для применения в невирусной генной терапии.
Работа также является одной из первых, кто показывает, что определенные последовательности ДНК-NLS функционируют лучше в определенных типах тканей: ткань печени содержит специфические пептиды NLS, которые лучше подходят для ядерной транслокации, чем если бы они использовались в сердечной или почечной ткани. конъюгаты могут быть использованы для тканеспецифичной доставки.
Команда хотела бы дополнительно изучить, снижает ли доставка конъюгатов ДНК-NLS в клетку иммунный ответ - еще одно препятствие на пути такого рода генной терапии.
